DNA volgorde afgelezen, hoe gaat dat eigenlijk in zijn werk?

Het aflezen van DNA volgordes wordt vaak aangeduid met de Engelse term "sequencing" (Wikipedia). Het aflezen van DNA volgordes werd voor het erst mogelijk rond 1975. Aanvankelijk werden er twee methodes ontwikkeld, een chemische (Maxam-Gilbert sequencing) en een enzymatische (Sanger dideoxy-sequencing). Na enige tijd bleek de Sanger methode de duidelijke winnaar en de methode wordt tegenworrdig nog steeds gebruikt. Uitleg over de Sanger methode vind je op bijv. Microbiologie.info., Bioplek (met animaties) en bij AllesOverDNA.

 

NGS (Next Generation Sequencing)

Tegenwoordig lezen we DNA volgordes af met een ongekende snelheid. We doen dat met een nieuwe afleestechnologie die wordt aangeduid als NGS, "Next Generation Sequencing". Een vreemde naam, "volgende generatie", voor iets wat je nu al gebruikt. NGS kan onderverdeeld worden in “second generation sequencing” en “third generation sequencing”.

Wat maakt deze technologieën anders en zoveel krachtiger dan de tot nog toe gebruikte, de Sanger methode? Het belangrijkste verschil is dat bij NGS geen gebruik meer wordt gemaakt van het op lengte scheiden van de stukken DNA om de letters af te kunnen lezen. Dit op lengte scheiden is niet alleen kostbaar maar ook lastig om voor hele grote aantallen te doen.

 

Het DNA klaar maken

Na het isoleren van het DNA worden de lange DNA draden eerst in stukken gebroken. Voor de 2e generatie aflezen proberen we stukken van 300-400 letters lang te krijgen. Door het breken zijn de stukken van de dubbele DNA draad vaak rafelig, de ene DNA-streng is wat langer dan de andere. De stukken worden daarom eerst behandeld om mooie vlakke uiteinden te krijgen. Dat gaat heel simpel, je voegt een enzym toe dat enkel-strengs DNA afbreekt (met dubbel-strengs DNA gebeurt niks).

Dan worden aan beide uiteinden stukjes van 30-60 letters lang geplakt, de "linkers". De linkers hebben een bekende DNA lettervolgorde en zijn nodig om de stukken DNA in een volgende stap te kunnen vermenigvuldigen. De linkers kunnen ook worden gebruikt om aan DNA van verschillende personen een unieke code te plakken. Je kunt het DNA van verschillende personene dan mengen, aflezen en na het aflezen aan de hand van de unieke code weer scheiden. Tot slot worden de DNA stukken op lengte gescheiden (m.b.v. electroforese, Bioplek animatie) en de stukken met de gewenste lengte (300-400 letters) er uit gehaald.

 

Van één stukje naar een kluitje kopieën

Bij de 2e generatie aflezen worden alle stukjes DNA vervolgens ieder apart opgewerkt. De DNA stukjes worden aan een drager gebonden, vermenigvuldigd en tot slot met tientallen miljoenen tegelijk afgelezen.

Het uiteindelijke aflezen wordt gedaan door het DNA op te laten lichten. Eén DNA molecuul geeft te weinig licht om dit betrouwbaar op een foto te kunnen zien. We moeten daarom de losse DNA moleculen een tienduizend keer vermenigvuldigen om zo een kluitje identieke DNA moleculen te krijgen die samen genoeg licht geven. De stukken DNA worden daarom aan een vaste drager gebonden, een bolletjes of een glasoppervlak. Van de stukken DNA worden nu m.b.v. de PCR methode (Bioplek animatie) tienduizenden kopieën gemaakt.

Bolletjes

De stukken DNA worden met bolletjes gemengd, waarbij het de bedoeling is dat zich aan ieder bolletje maar één stukje DNA bindt. Dat gaat eigenlijk heel simpel; neem 10x zoveel bolletjes als er stukjes DNA zijn en meng goed. De bolletjes worden dan omsloten met een vloeistof ("emulsie") die alle benodigde stoffen en een eiwit bevat om het DNA m.b.v. de PCR methode te kunnen vermenigvuldigen. Na de PCR wordt de emulsie verwijderd en worden de bolletjes met DNA gescheiden van de bolletjes zonder DNA (dat zijn er veel meer). De bolletjes met DNA worden vervolgens gebruikt om de lettervolgorde af te lezen. De techniek met bolletjes wordt gebruikt door de firmas 454 (nu Roche) en Ion Torrent/Life Technologies.

Glasoppervlak

Een andere manier is om de losse stukjes DNA niet aan een bolletje te plakken maar op glas. Om te voorkomen dat de DNA draden te vlak bij elkaar zitten, of te ver uit elkaar liggen, moet je precies de goede hoeveelheid DNA gebruiken. M.b.v. de PCR methode wordt van elk DNA stukje weer tienduizenden kopieën gemaakt. De kopieën zijn aan het glas gebonden, in de buurt van het eerste stukje DNA. Zo ontstaat op het glas een kluitje DNA van één stukje. Uiteraard voorkom je zoveel mogelijk dat de verschillende kluitjes DNA te dicht bij elkaar liggen en je ze niet meer apart ziet. Deze methode is ontwikkeld door de firma Solexa (nu illumina).

Het aflezen

Het eigenlijke aflezen van de lettervolgorde, de DNA code, gaat op verschillende manieren. Standaard is dat een DNA-streng door een enzym ("polymerase") wordt gekopieerd en dat je kijkt welke letter (A, C, G of T) op een bepaald moment aan de groeiende kopie wordt toegevoegd. Je volgt daarbij telkens één van de kluitjes met DNA kopieën, zij geven allemaal samen een lichtsignaal dat je kunt zien, meestal als een stipje op een foto.

Bedrijven en hun technieken

De firma 454 (nu Roche) was in 2005 de eerste die een NGS apparaat verkocht. Het DNA wordt afgelezen met de "pyrosequencing" techniek. Als een letter in de kopie wordt ingebouwd dan geeft dat een lichtsignaal, dat op een foto wordt vastgelegd. Per stap wordt één letter toegevoegd die wel of niet wordt ingebouwd wat wel of geen lichtsignaal geeft. Per stap wordt één foto gemaakt en in de volgende stap voeg je de volgende letter toe; A dan G dan C dan T dan A dan G, enz. Uniek aan de pyrosequencing is dat als op een bepaalde plaats er een paar van dezelfde letters achter elkaar zitten deze in één keer direct achter elkaar worden ingebouwd. Bij de inbouw van bijvoorbeeld 4 T's is het afgegeven lichtsignaal is dan 4x zo sterk. Op Youtube vind je een mooie animatie van deze technologie.

Het systeem van de firma Illumina (ontwikkeld door Solexa) werkt met DNA letters in 4 verschillende kleuren; geel voor A, blauw voor G, rood voor C en groen voor T. De DNA letters zijn zo gemaakt dat je bij het maken van de kopie telkens maar één letter kunt inbouwen, de letters zijn chemisch geblokkeerd. Per stap wordt één foto gemaakt en aan de kleur van een stip kun je zien welke letter werd ingebouwd. Na het maken van de foto worden de kleur en de blokkering verwijderd en kan de volgende letter worden ingebouwd. Maak je nu een serie fotos en volg je één stipje, één kluitje DNA kopieën, dan geeft de kleur de DNA lettervolgorde aan. Rood, rood, geel, groen, blauw was CCAGT. Op Youtube vind je een mooie animaties van deze technologie; animatie-1, animatie-2.

De Ion Torrent/Life Technologies technologie werkt ongeveer hetzelfde als die van 454/Roche. Bij inbouw worden echter geen lichtsignalen afgegeven en gefotografeerd maar kleine elektrische signalen gemeten. Deze elektrische signalen ontstaan doordat de inbouw van een DNA letter de omgeving van het kluitje DNA kopieën zuur maakt. Dit verschil in zuurgraad (de "pH") wordt gemeten. De letters worden weer één voor één toegevoegd (A dan G dan C dan T dan A dan G, enz) en al dan niet ingebouwd wat vervolgens wel of geen zuurverschil geeft. Worden 4 dezelfde letters achter elkaar ingebouwd, bijv. 4 T's, dan geeft dit een 4x sterker signaal. Op Youtube vind je een mooie animatie van deze technologie.

De systemen van SOLiD/Life Technologies (technologie) en Complete Genomics (technologie) werken weer iets anders. Uniek aan Complete Genomics is dat je geen systeem kunt kopen om het DNA af te lezen, je kunt alleen DNA opsturen zodat de firma het voor je afleest.

De toekomst

De ontwikkelingen staan echter niet stil en de eerste systemen van de 3e generatie technologie zijn inmiddels in gebruikt. Bij 3e generatie aflezen is de afleesmethode nog verder versimpeld; het aflezen gebeurt nu vanaf één DNA molecuul, "single molecule sequencing". In tegenstelling tot 2e generatie aflezen hoeft het DNA bij 3e generatie niet meer vermenigvuldigd te worden. Dit is mogelijk doordat er met veel gevoeliger apparatuur (camera's) een opname gemaakt wordt van het afgegeven lichtsignaal.

De afleesmethode van de firma Helicos (Youtube) werkt daarbij met alle letters in één kleur die één voor één worden toegevoegd (A dan G dan C dan T dan A dan G, enz.). Inbouw van één letter geeft een lichtsignaal op de foto, inbouw van een twee letters tegelijk is onmogelijk gemaakt doordat de letters chemisch geblokkerd zijn.

Het systeem van Pacific Biosciences werkt met 4 kleuren, één per letter. Inbouw gebeurt niet meer per stap maar er wordt een filmopname gemaakt van een enzym (polymerase) dat een stuk DNA aan het kopieren is. Telkens wanneer een letter wordt ingebouwd zie je een lichtsignaal, waarbij de kleur aangeeft welke letter wordt ingebouwd. Bekijk je de film en zet je de lichtsignalen achter elkaar dan heb je de lettervolgorde van het stuk DNA (Youtube animatie-1, animatie-2). In vergelijking met de eerder genoemde technieken, die per stukje DNA een paar letters per uur aflezen, is de technologie van Pacific Biosciences razendsnel, de DNA volgorde wordt afglezen met 2-3 letters per seconde!

De technologie van de firma Oxford Nanopore (Youtube) maakt gebruik van een nanopore om de DNA volgorde te bepalen. Een nanopore is een héél klein gaatje in een oppervlak waar een DNA draad doorheen wordt getrokken. Door de electrische weerstand (een ladingsverschil) over het gaatje te meten kun je bepalen welke DNA letter er door het gaatje getrokken wordt. Met de computer kan de DNA volgorde door middel van de verstoring van de stroom bepaald worden.